连续上游、下游和制剂工艺
本文节选自《Developments and opportunities in continuous biopharmaceutical manufacturing》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
生物药连续生产中部分步骤的技术方案。a）使用交替式切向流过滤（ATF）作为细胞截留装置，以进行灌流细胞培养；b）3-柱周期性逆流层析柱，用于产物捕获，以及2-柱溶剂梯度纯化方法，用于产物精制；c）连续填充床病毒灭活装置；以及d）中空纤维透析装置，用于连续超滤和洗滤。
连续上游工艺
连续细胞培养的“赋能”技术，灌流生物反应器，被行业引入用于提高细胞滴度。新鲜的培养基连续补加，同时，以相同的速度，连续去除营养成分耗竭的培养基。细胞培养液进入细胞截留装置，部分细胞培养基进入收获端，而细胞返回至生物反应器。此外，可以通过细胞废弃（Cell Bleed）去除死细胞，提高细胞活性。由于灌流生物反应器内液体的连续流动，细胞平均滞留时间更短，分布更窄，从而使产品质量相比批次和补料分批生物反应器更一致。
相比补料分批，灌流培养中除了更加一致的细胞活性，通常还可获得更高的产量。代谢废物和其它杂质的累积更低。在补料分批反应器中，由于缺乏连续的液流，导致产物滞留时间分布（RTD）可横跨从细胞培养开始到结束的整个阶段。这种在生物反应器内差异性高且持续时间长的产物滞留时间会导致出现不希望出现的产物质量，如聚集、片段化、化学修饰以及翻译后修饰，如糖基化，的变化。由于灌流生物反应器内产物更短的滞留时间，对于某些产品，特别是生产有降解倾向的治疗性蛋白时，灌流是首选的细胞培养方法。
鉴于灌流培养所带来的好处，这种连续的上游操作已被纳入许多商业化工艺。在1993年至2003年期间，有14个使用灌流细胞培养的生物制药工艺获批，在2004年至2014年期间又有8个生物制药工艺获批。灌流增长速度的下降可能可归因于提高生产力的其它替代途径的出现，如细胞工程的改进、培养基配方以及生物反应器的设计和控制，提高了细胞和产物的滴度，可将14-18天培养的补料批次技术从~ 5 x 10^6 cells/mL和1-2 g/L提高到~ 15 x 10^6 cells/mL和9-10 g/L。此外，在灌流生物反应器中，新鲜培养基的连续补加以及耗竭培养基的连续去除导致需要大量的培养基以及相关的存储和处理操作。然而，与培养基组成相对固定的商业化培养基不同，针对灌流而优化和开发的培养基可以通过允许使用更低的灌流速率以及更小的培养基体积而降低成本。培养基和灌流速率的优化可在现有优势的基础上实现进一步的提升，即更高的产率，更低的占地面积，以及与下游工艺整合的能力，最终降低与灌流工艺相关的更高成本。
灌流生物反应器的使用已经超出了其作为生产生物反应器的用途，而扩展到其在以灌流为基础的高密度细胞建库工艺中的使用，这可以减少通常在传统种子扩增中看到的扩增步骤数量。此外，在种子培养的N-1阶段使用灌流生物反应器可提高接种密度并缩短生产罐的细胞培养生长期。总的来说，高密度细胞建库、一次性使用波浪式生物反应器和N-1灌流培养的组合缩短了种子扩增过程，同时降低了人工操作和污染的风险。
细胞截留装置是灌流生物反应器运行的关键“赋能”部件。细胞澄清可在生物反应器内部通过旋转滤器或浸没式膜过滤器进行，或依序在基于过滤、离心或超声聚集的独立装置中进行。旋转滤器已用于基于哺乳动物细胞灌流培养的单克隆抗体工业化生产。虽然浸没式中空纤维过滤器和旋转滤器都可以反冲，但在操作中膜污染仍然是一个挑战。事实上，旋转滤器的污染问题已经促使原开发公司对已获批的单抗澄清工艺进行了修改。
细胞截留也可以在单独的过滤装置中完成，如切向流过滤(TFF)装置。然而，在TFF中，细胞培养液通过蠕动泵的再循环会引起剪切损伤和细胞裂解，这在交替式切向流过滤(ATF)中得到了改善 (图1a)，在交替式切向流过滤中，通过隔膜泵，使培养液沿膜表面交替往复流动。虽然ATF是目前最流行的细胞截留技术，但在优化细胞生长和生产力时，必须考虑其细胞滞留时间。膜污染也必须通过优化进行缓解，因为它会降低膜渗透性和滤液流速。有报导使用连续微流装置实现截留，同时通过可变的料液流速周期性地冲洗膜，这种设备占地面积小，但需要进一步优化，特别是在更大规模的应用中。
另一种截留细胞的方法是使用高频共振超声波，而不是膜，其可在从开发到商业化规模的条件下，选择性地从收获细胞培养液截留活细胞。尽管声学设备已与200L/day的灌流细胞培养相结合，但进一步放大后，分离效率会出现显著的下降，需要深层过滤等二级澄清方法。此外，也可以使用连续离心。尽管连续固体排放离心机可以比周期性固体排放离心机更有效地澄清收获液，但规模放大仍然是一个挑战。使用离心很难实现完全的“澄清”，通常需要深层过滤来进行进一步的澄清。
连续下游工艺
纯化效率的提升没有跟上产物滴度的提升，使得下游纯化成为生物工艺的一个潜在瓶颈。实际上，通过向连续操作的过渡，可以实现下游生产力的显著提高。对于最大的生物药类别 -单抗来说，典型的平台纯化工艺包括Protein A层析、低pH保持病毒灭活步骤、一个或多个精制层析步骤、一个除病毒过滤步骤以及一个超滤/洗滤（UF/DF）步骤。这些纯化设备的操作是按顺序进行的。连续的纯化将使工艺不间断地进行。
在mAb的纯化中，成本最高的单元操作是Protein A亲和层析，它从细胞培养液中捕获产物mAb，同时允许其它蛋白质不结合地流过层析柱。然后使用低pH缓冲液将结合产物从层析柱中洗脱，并在容器中保存约一小时，以灭活病毒。Protein A层析的批次模式操作至少在两个方面没有吸引力。首先由于样品上样后在漂洗、洗脱和再生层析柱上花费的时间较长，导致整个操作效率较低。其次是传质限制，这妨碍了对填料全部载量的利用率，当mAb流穿时，停止层析柱上样，以避免收率的损失。
为了克服填料利用率低的问题，多柱工艺，如周期性逆流层析 (PCC) (图1b)、顺序多柱层析和模拟移动床层析 (SMB)，将一根层析柱的流穿液捕获上样至另一根层析柱。对两根或更多的层析柱进行组织，以使其交替处于上样和洗脱/再生阶段，以提高操作时间和产率。与批次操作相比，即使只是针对产物滴度＞2mg/mL的样品将层析柱数量增加到两根 (Capture SMB)，也可以显著提高层析柱生产力和填料利用率。与批次操作相比，连续多柱方法只需要更低的填料体积和循环时间，即可用于生产相同数量和质量的产品，实现成本节约。虽然已经有研究完成了这种操作方式从实验室到中试规模和临床生产的验证，但商业化生产的实施还有待观察，主要原因是设计和操作的复杂性，其涉及为数众多的阀门、自动化和控制，以及对PAT集成的需求。
使用吸附膜可以部分地缓解柱层析的传质限制，其可以使用更高的流速，减少纯化时间，并提高产率。用于mAb亲和捕获的膜可能可以整合配基，如Protein A。尽管这些膜吸附产品没有填充床亲和层析法的载量，导致了更高的缓冲液需求和更高的工艺质量密度，但当膜吸附用于连续捕获时，可以缓解这些挑战。此前有文章报道了一种连续的四膜吸附周期性逆流层析系统，该系统与ProteinA柱层析相比具有更高的通量。此外，新一代吸附膜的载量也有了相当大的提升。
虽然熟悉的多柱层析设置是连续产品捕获的主要选择，但也有研究提出了非柱和非层析的方法。与多柱法不同，无柱连续逆流切向层析 (CCTC) 是在稳定状态下操作的。CCTC采用了静态混合器，提高了填料浆液和细胞培养液的接触率，中空纤维膜组件可以滤过产物和杂质，但不能滤过到填料基球。截留液和滤液反向移动并合并循环。这种连续操作可能更容易与灌流细胞培养相结合，并显示出与批次层析柱操作相当的产量和纯度，且具有更高的产率。虽然在CCTC中捕获所需的保留时间只有7-12 min，而ProteinA层析柱≥1小时，基于浆液的操作导致比层析柱更高的稀释，因此需要更大的缓冲液体积。尽管最近在努力解决这些问题，但这项技术需要进一步开发，才能用于工业化应用和长时间连续处理。
虽然吸附方法更流行，但产物也可能使用水两相萃取 (ATPE) 捕获，这是一种液-液分馏技术，利用两个不混相的聚合物或聚合物与盐驱动的相分离。亲和配基也可以加入到ATPE中，以提高工艺的选择性。这种方法在制备规模中可以拥有高配基浓度的单位体积聚合物溶液，实现更高的产率。尽管在过去的几十年里，ATPE的许多应用已经得到了证实，但用于mAb纯化的连续中试和小型工厂规模的ATPE系统最近才得到证实。将双水相体系与膜以及传统平台纯化工艺相结合的努力，可获得74-78%的mAb收率，糖型没有变化。为了使ATPE在生物生产中大规模应用，可能需要进一步的工艺成熟和产量的提高。
mAb捕获步骤后，通常以批次模式进行病毒灭活，将低pH Protein A洗脱液在一个大容器中保存约1小时。这步操作也可以连续进行，如最近研究所介绍，使用窄保留时间分布（RTD）的连续反应器，仅在15min后就观察到显著的病毒灭活。为了确保适当的最低保留时间，FDA建议对连续病毒灭活进行RTD评估。为此，行业提出了三种病毒灭活反应器设计：螺旋流逆变器、称为“jig-in-a-box”（盒子中的吊钩）的管状反应器以及填充床反应器 (图1c)。在前两种设计中，由于螺旋结构和交替270°转弯的存在，径向混合得到了增强。在填充床反应器中，无孔颗粒保证了狭窄的RTD。总的来说，这些进展表明，病毒灭活可能适用于连续生产。然而，在将连续病毒灭活反应器与周期性处理样品的多柱层析方法相结合的过程中，仍然存在挑战。随着时间的推移，亲和洗脱液的pH和浓度的变化也可能阻碍病毒连续灭活的性能，需要额外的保持步骤。除病毒灭活外，除病毒过滤也可在较低压力条件下连续进行较长时间，但必须仔细选择适合这种操作的过滤器，或者考虑使用多过滤器设置。
使用结合/洗脱层析进行的精制步骤可以使用与前面讨论的捕获层析相似的方法连续操作。主要的方法是多柱层析法，如SMB和多柱逆流溶剂梯度纯化(MCSGP)(图1b)。这些方法通过色谱重叠区域的内部循环，克服了批次层析中存在的纯度-收率的权衡问题。SMB工艺不允许线性梯度，首选用于体积排除、疏水作用和混合模式层析操作。捕获SMB和单柱操作之间的比较表明，尽管保留时间和上样量不同，但病毒清除效果相似。
与等度SMB工艺相比，MCSGP结合了连续逆流迁移和溶剂梯度，以分离两种以上组分的混合物，使其适合于连续离子交换层析。在精制工艺中，洗脱阶段利用内部循环，而不是在上样过程中，如捕获工艺中的方式。MCSGP已被用于分离mAb的电荷异构体、聚体和片段。
在精制层析中，使用结合-洗脱模式的一种可能方法是进行迎头上样（frontal loading），在这一过程中，柱超载，开始竞争性结合，与填料有更强亲和性的竞争物质取代结合较弱的蛋白质。因此，除了在洗脱过程中，在样品上样过程中也实现了显著的分离。如果杂质的结合比产物的结合更强，这种方法尤其有效，就像在阳离子交换填料上，聚体和碱性杂质相比mAb的情况一样。在迎头操作时，产物的结合较弱，在柱上的保留时间较短，也可减少柱上的潜在展开。尽管有这些好处，由于对工艺稳健性的担忧，迎头层析在生物工艺中还没有广泛应用。然而，由于它可以提高精制步骤产率，降低生产占地，而且它也可以在连续工艺中实施，因此它在旨在实现工艺强化的努力中再次出现。近来，有研究提出了一种连续双柱逆流迎头层析法，以从单体中分离mAb聚体。此外，也有研究提出了利用产物和杂质(如聚体、宿主细胞蛋白和电荷异构体)之间置换的多柱层析方法；这些方法可以适应连续操作。
在产物不与填料结合的情况下，结合的杂质可以使用流穿层析分离。考虑到在纯化的精制阶段通常看到杂质的水平较低，流穿分离可以通过减少所需的填料和介质的用量，来提高生产率。此外，由于没有产物洗脱步骤，允许获得产物的连续液流。两个或更多的流穿单元操作已经被集成用于抗体的精制和完整纯化。尽管有了这些发展，多柱精制系统设计的复杂性仍然阻碍了在生产中的实施。工艺建模和模拟可以缓解“预感”的风险，因为它们可以与实验一起，协助工艺开发和优化。一次性使用技术，如膜吸附，也适用于流穿应用，在这里，对其吸附载量要求较低。仅使用商业化膜吸附产品的连续纯化链可实现更高的流速和更高的生产率，使其特别适合于临床生产。
在典型的下游工艺中，层析步骤通常最受关注，因为它们能够实现高选择性的分离，但同时它们也最具有挑战性，难以转换为连续操作。而缓冲液置换和/或产品浓缩也是必要的步骤，通常是为了调整一个层析步骤的洗脱液，以便上样到下一个步骤。这可以通过超滤/洗滤(UF/DF)操作来实现，UF/DF相对易于实现连续操作。采用单通过TFF (SPTFF) 进行的TFF可以连续操作，并已用于工艺内单元操作之间的产物“在线”浓缩。然而，连续UF/DF需要多个SPTFF组件依次进行浓缩和缓冲液置换。最近，有研究提出了一种中试规模的3阶段SPTFF连续工艺。SPTFF装置的顺序排列允许进行多次体积降低，然后用洗滤缓冲液稀释，缓冲液交换率可达> 99.75%。以逆流模式操作这样的膜组件可以减少对缓冲液的需求。这种脱盐和缓冲液置换操作可以通过使用预灭菌中空纤维组件来降低成本、缓冲液和操作复杂性，其具有更短的流路长度和更大的表面积，需要的进样流速更低 (图1d)。使用中空纤维系统实现连续和一次性使用蛋白质浓缩 (10倍) 和缓冲液置换 (99.9%)的操作已被证实，并可集成到连续的生物生产。
为了避免使用多个SPTFF单元，最近提出了一种3D打印双膜装置的初步设计模型，该装置可以同时实现UF和DF。该设计限制了两层膜之间的进料液流，进料液流上方和下方的压差可以同时实现浓缩 (4.5倍)和盐的降低 (47%)。作者表示，为了提高该工具的性能，需要在尺寸减小、平行化和简化装置液压方面做更多工作。
连续制剂工艺
生物药被制剂成高浓度液体或冻干固体制剂；大约三分之一的成功单抗制剂是冻干的，而其余的是浓度为2- 200 mg/mL的液体。对于稳定的产物，液体制剂优于冻干制剂，因为它们更容易生产和管理。上一节讨论的UF/DF策略可以使产物连续浓缩并置换到所需的缓冲液中，以进行制剂和纯化，而膜工艺对连续操作的先天适用性使得制剂 (至少是液体制剂) 特别适合基于批次工艺进行调整。
原文：O.Khanal,A.M.Lenhoff, Developments and opportunities in continuous biopharmaceutical manufacturing. mAbs, 2021, 13:1, 1903664.
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